PROGRAMA TEORICO GENERAL 

Introducción al uso de levaduras. Historia de su uso. Metabolismo: fermentación y respiración. Similitudes y diferencias entre Saccharomyces cerevisiae y Schizosaccharomyces pombe. Ciclos de vida de ambas levaduras. Nomenclatura. Levaduras en el árbol evolutivo. Otras levaduras de importancia: Pichia pastoris y Candida albicans.

Herramientas para las modificaciones genéticas en Saccharomyces cerevisiae y su uso en biotecnología. Sistemas de transformación de levaduras. Marcadores genéticos. Clonado por complementación y por gap repair. Insercion/disrupcion de multiples fragmentos de PCR. Vectores. Promotores constitutivos, inducibles y reprimibles en S. cerevisiae. Mutantes, mutagénesis, sistemas de selección, contraselección y screening. Expresión de genes heteróloga para la producción a pequeña y gran escala.

Genética molecular en Schizosaccharomyces pombe. Disrupción génica en un paso por recombinación. Detección de recombinantes homólogos e ilegítimos. Vectores, promotores y marcadores genéticos de S. pombe. Tecnología Gateway y por gap repair para el clonado en vectores de S.pombe. Tagging genómico. Colecciones de deleciones y de fusiones a GFP. Robots para la manipulación de mutantes a gran escala.

Biología de sistemas. Homeostasis molecular. Genotipo y fenotipo. Análisis de interacciones genéticas sintéticas, fitness. Medida cuantitativa de interacciones genéticas. Epistasis. Sistemas y propiedades de los sistemas. Análisis genético usando colecciones ordenadas de deleciones. Ontología genética. Redes.

Estudios bioquímicos y funcionales a nivel proteómico. Levaduras como sistema de expresión. Estrategias de clonado y etiquetado a nivel genómico. Análisis a escala proteomica: Bioquímica genómica, Interactoma, proteómica de modificaciones post-traduccionales, proteómica cuantitativa, localizoma, análisis funcional en levaduras S. cerevisiae.

Biodiversidad y Biotecnología de levaduras. Diversidad de levaduras y sus usos en biotecnología. Filogenias moleculares. Nuevas especies y poblaciones de levaduras de la Patagonia. Levaduras extremófilas.

Biología celular en levaduras. Transporte intracelular en S. cerevisiae. Vía secretoria. Mutantes sec. Screening de mutantes de la vía endocítica. Microscopia de fluorescencia en levaduras. Visualización y cuantificación de tráfico de vesículas usando proteínas fluorescentes. Análisis de imágenes.

Sistemas de doble híbrido en levaduras. Interacciones no covalentes entre proteínas. Detección sistemática de interacciones proteína-proteína con metodología a gran escala ("high throughput"). Descripción del sistema de doble híbrido, potencia y limitaciones. Historia del sistema y sus usos. Variantes un híbrido y tri-hibrido. Vectores, operadores, reporteros de interacción.

Aplicaciones biotecnológicas de las levaduras: Caracteristicas de levaduras industriales. Aplicaciones clásicas: industrias panadera, enológica y cervecera. Uso en la producción de biocombustibles. Criterios de selección y desarrollo de cepas. Desafíos en la transformación de levaduras industriales. Mejoramiento de la fermentación

Ingeniería de cromosomas de levaduras: Estrategias para la construcción de levaduras con un único cromosoma. Ventajas y aplicaciones. Importancia en las aplicaciones biotecnológicas

Bases de datos.  Sitios web relacionados con levaduras. Saccharomyces genome database (SDG) y PomBase. Sitios para el acceso a protocolos y secuencias

 

TRABAJOS PRACTICOS

• Medios de cultivo, selección y cruzamiento de levaduras S. cerevisiae y S. pombe. Construcción de mutantes simple y múltiples por metodologías de genética clásica y molecular
• Preparación de levaduras competentes. Transformación con plásmidos de expresión con promotores constitutivos y regulables. Criterios de elección de medios de selección
• Ingeniería de levaduras para el mejoramiento de la producción de bioetanol: Construcción de levaduras knock out para un gen específico que mejora la producción de etanol de primera generación (a partir de la fermentación de sacarosa). Determinación de recombinantes homólogas por PCR.
• Determinación de niveles de azucares y de etanol para evaluar la capacidad fermentativa de cepas de levaduras
• Expresión de genes heterólogos: rescate de fenotipos mutantes por complementación.
• Interacción de proteínas in vivo: Ensayo de doble hibrido y detección de interacción entre dos proteínas y variantes mutadas por diferentes reporteros. Controles del sistema de doble híbrido.
• Microscopía confocal de proteínas fusionadas a reporteros fluorescentes. Colección de fusiones a GFP. Localización subcelular. Visualización de organelas de levaduras S. pombe y S. cerevisiae. Endocitosis en tiempo real por microscopia confocal.